欢迎来到第109期!

本月博客的主题是 ABRF iPRG 2023 crosslinking study，该研究将持续到 1 月 15 日，如果您参与了这项研究，我们鼓励您使用公共免费版本或内部版本的 Mascot 进行数据分析

本月的特色文章利用CRISPR基因敲除技术，展示了N端乙酰化在蛋白质稳定性中的作用。如果您有近期发表的论文，希望我们考虑刊登在即将出版的Newsletter上，欢迎您发送PDF或URL给我们

本月Tips是关于设置内源碎片以获得更佳搜库结果

如果您有任何意见或问题，请随时联系我们

Mascot： 深受客户信赖25年的蛋白质质谱鉴定标准参考软件

ABRF iPRG 2023 Crosslinking Study

ABRF proteome informatics research group (iPRG)现已启动一项新的交联研究：

本研究旨在从蛋白质组学研究界获取有关分析交联肽 MS 数据的不同方法，展示交联分析可用的多种不同工具，并为改进交联 MS 数据搜索结果的展示提供指导。

我们准备了一个 Mascot 分析教程，帮助您在交联分析中取得更好的结果，以下是步骤概述：

• 在Mascot Server上准备好与该数据集相匹配的参数配置
• 在 Mascot Server和 Distiller 中搜索数据
• 评估交联肽的结果
• 将结果导出至 xiVIEW，以便进一步分析和可视化

如果您没有商业版 Mascot Server，但又想搜索以上的数据集，欢迎使用公开的 Mascot Server，请联系我们申请一个扩展限制后的免费临时账号，以进行对数据量更大的完整数据集搜索。

此数据为高分辨率 MS/MS，我们在 Mascot Distiller 上进行了峰值提取处理。与普通多肽相比，交联多肽因其结构可能具有非常高的质量值和高电荷状态；三价以上的碎片离子峰要么被去电为 MH⁺（相当于一价），要么在 MGF 文件的每一行中将峰的电荷信息一起输出，这样多价峰也可用于搜索，以上两种方式都有利于后续的数据库搜索。

教程的最后一部分是分析结果。 我们之前发布了一些验证完整交联肽匹配的指南，您可以使用这些指南来确定什么是良好的匹配，什么匹配并不足以说明与验证交联。

请访问我们的博客，下载完整的教程和数据文件。

使用Mascot发表的特色文章

在这里，我们重点介绍了最近有趣且重要的文章，该文章采用Mascot进行蛋白质鉴定，定量或表征，如果您想要您的文章也在这里重点推荐，请发送给我们PDF或URL。

N-terminal acetylation shields proteins from degradation and promotes age-dependent motility and longevity

Sylvia Varland, Rui Duarte Silva, Ine Kjosås, Alexandra Faustino, Annelies Bogaert, Maximilian Billmann, Hadi Boukhatmi, Barbara Kellen, Michael Costanzo, Adrian Drazic, Camilla Osberg, Katherine Chan, Xiang Zhang, Amy Hin Yan Tong, Simonetta Andreazza, Juliette J. Lee, Lyudmila Nedyalkova, Matej Ušaj, Alexander J. Whitworth, Brenda J. Andrews, Jason Moffat, Chad L. Myers, Kris Gevaert, Charles Boone, Rui Gonçalo Martinho & Thomas Arnesen

Nat Commun 14, 6774 (2023)

本文章研究了 N 端乙酰化在蛋白质稳定性和降解中的作用。 同时，还研究了它们对细胞过程、寿命和运动能力的影响。 在这项研究中，他们针对人类 HAP1 细胞和黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）进行了全基因组 CRISPR 基因敲除筛选。结果发现，N端乙酰化可保护疏水的N端不被定向降解，乙酰转移酶NatC的波动可调控囊泡运输和细胞器形态。

本研究采用了新一代测序、流式细胞仪分析、细胞分拣、共聚焦成像、免疫印迹分析和质谱蛋白质组学等分析方法。在 MS 分析中，使用低 pH 强阳离子交换色谱法富集 N 端肽段。为了检测体内发生的 N 端乙酰化，使用含有重同位素的乙酸 N-羟基琥珀酰亚胺酯在蛋白质水平上阻断蛋白质的所有伯胺，这样就可以区分体内和体外乙酰化的 N-端，并计算出体内和体外乙酰化的 N-端比例。他们对质谱数据进行了两次搜索，一次是对乙酰化的 N 端进行定量分析，另一次是用于鉴定包括非N-端乙酰化的肽在内的所有肽段。使用 Mascot Distiller（+Quantitation Toolbox）中分别计算的light/heavy ratio获得体内乙酰化水平。

无标记定量分析比较了 HAP1 WT 细胞和乙酰转移酶基因敲除（KO）细胞的定量，通过多元方差分析检验确定了 WT 和 KO 之间有差异表达的 440 个蛋白质，被判定为显著差异的 346 个蛋白质在单因素方差分析中也被认为是显著的，其中 66% 的蛋白质与 WT 相比表达量减少，34% 的蛋白质与 WT 相比表达量增加。

匹配内部片段峰，获得更好的 HCD结果

高能碰撞解离（HCD）往往会产生内部碎片离子，特别是在阶梯碰撞能量设置下。 Mascot支持内源碎片的匹配，但内源碎片并不出现在默认设置中，建议您在搜索 HCD 数据进行分析时，尽量将内部碎片离子考虑在内。

冷泉港实验室的达里尔-帕平（Darryl Pappin）在 2023 年 7 月的博客中介绍了一个非常好的分析示例，此分析中使用的数据含有81,267个Query，只需启用 ya 和 yb 系列离子的匹配，1% PSM FDR的匹配率就提高了 16%，肽段匹配率提高了 13%。通过考虑与内部片段离子的匹配，Mascot 能够将之前被判定为噪声的峰标记为内部片段峰，这往往会提高匹配分数。它在分析交联肽数据时也很有用，这是因为在交联分析中，整个肽链的碎片往往很稀少，这时内部碎片会是两条交联链中的一条或另一条的唯一有力证据。

About Matrix Science

Matrix Science 为蛋白组学的研究人员以及科学家提供生物信息分析工具，帮助他们更快速，更可信的鉴定和定量蛋白。Mascot 软件全线支持来自 Agilent, Bruker, Sciex, Shimadzu, Thermo Scientific 以及 Waters质谱仪生成的质谱数据。

请联系康昱盛以获取更多的信息。

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