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N-Terminal protein sequencing by nicotinic acid derivatization and MS analysis
烟酸衍生化结合质谱分析进行蛋白质N端测序
Peter Gehrig, Simone Wüthrich, Serge Chesnov, Ralph Schlapbach and Paolo Nanni
Anal Bioanal Chem (2026), doi:10.1007/s00216-026-06727-4
单个基因可产生具有不同N端的多种成熟蛋白质形式(proteoforms),这些形式可源于起始甲硫氨酸的切除、信号肽和前肽的切割、氨肽酶的修剪、RNA剪接以及翻译后修饰。在大多数基于质谱的N端测序流程中,对N端氨基(以及赖氨酸侧链的氨基)进行化学衍生化是必不可少的一步。常用的方法是在甲醛和氰基硼氢化钠(作为还原剂)的混合物中进行二甲基化,但该方法已被报道存在多种不良副反应,且甲醛和氰基硼氢化钠均为危险化学品。
近期这项研究的作者考察了用于蛋白质N端修饰的替代试剂。他们比较了几种化学标记策略,包括:用吡啶硼烷替代氰基硼氢化钠的传统还原性二甲基化、RapiFluor试剂、2-吡啶甲醛、TMT试剂以及烟酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(烟酸NHS酯)。每种方法均从标记效率、选择性、质谱灵敏度和副反应等方面进行了评估。
经数据依赖性采集液相色谱-串联质谱(DDA LC-MS/MS)分析后,研究人员使用Proteome Discoverer 2.1处理原始数据,并根据样品类型,用Mascot Server 3.0分别检索牛、马或大肠杆菌的UniProt蛋白质数据库。随后使用Percolator对结果进行优化,并应用1%的错误发现率(FDR),从而能够对不同衍生化方法进行比较。在所测试的方法中,烟酸N-羟基琥珀酰亚胺酯表现出尤为出色的效果,具有足够高的标记产率和强的MS/MS谱图,从而能够从多种测试蛋白中鉴定出N端肽段。
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