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新年快乐!

在本期内容中,我们对于如何区分不同的1Da 左右的修饰类型,给您提供了一些建议。

本月的特色文章对鉴定预期外的或者新的修饰类型提出了一个概述。如果您最近也有文章发表并且希望我们列举在下一期的Newsletter中,请发给我们 相关的PDF 或者URL

本月Mascot小贴士关于如何利用Protein Family Summary结果界面中的报告生成器(Report Builder)产生用户自定义的protein hit 列表。

如果您有任何意见或问题,请随时联系我们

 

2019.01

1 Da 修饰
本月特色文章
Mascot小贴士
 

一个Dalton, 多种可能性

当你遇到一个多肽的分子量加了一个Dalton,这通常对于确定具体发生了哪一种修饰是个巨大的挑战,因为1个Da的可能修饰实在是太多了。

通常比较初步的想法是,谱峰提取软件可能只是选择13C峰。如果是对于具有较高的质量精度而言,这是可以分类的。在分子量1500,肽段的13C质量数和脱酰胺修饰(Deamidation)之间的差异是13 ppm。此外,对于脱酰胺情况,MS/MS匹配中应显示一些带+1的碎裂,而13C多肽则没有。

当被修饰的氨基酸残基靠近氨基末端,且主要碎片离子是y离子时,因此只能观察到很少甚至没有 +1的峰(反之亦然) ,这使得鉴定修饰变得更加困难。

脱酰胺化与瓜氨酸化是特别棘手的,因为引起的质量数偏移是完全相同的。要确定是哪一种修饰,需要结合位点定位、异氰酸的中性丢失、瓜氨酸的加铵离子与理论谱图进行对比。

然后还有一种容易混淆的情况:15N(1)标签经常出现在容错搜索结果中。点击这里阅读关于如何解开这个问题,以及其他陷入1个Da修饰困境的内容。

deltas of nominal mass 1 Da

使用Mascot发表的优秀文章

在这里,我们列举了一篇近期发表的有趣并且很重要的文章,该文章运用Mascot 进行了蛋白质鉴定、定量及特性分析,如果您想要您的文章也在这里重点推荐,请发给我们一个PDF或URL。.

 

Identification of Unexpected Protein Modifications by Mass Spectrometry-Based Proteomics

Shiva Ahmadi and Dominic Winter

In: Wang X., Kuruc M. (eds) Functional Proteomics. Methods in Molecular Biology, vol 1871. Humana Press, New York, NY

作者提供了一种策略,复杂样本通过bottom up 的LC-MS/MS检测,以发现预期外的修饰类型。虽然可以选择预期的修饰通过设置成为可变修饰,很容易地对其进行鉴定,但未知修饰的鉴定就不那么简单了,需要进一步的数据分析和验证。

他们非常详细地描述了一个实验工作流程,包括:

  1. 并行搜索用于鉴定在预期外的氨基酸位点上发生的已知修饰类型
  2. error tolerant search方法用于发现样本中未预料到的,但是大家已经有所了解的修饰
  3. Mass tolerant search用于发现全新的修饰

此外,他们建议后续对初始数据集中已鉴定的修饰进行后续验证,并使用合成肽进行有针对性的实验。

他们通过分析HeLa细胞的胞浆组分来说明流程。通过LC-MS/MS,作者对烷基化试剂的单体和二聚体产生的大量副反应进行了鉴定和定量(见右图)。他们还确定了含碘的烷基化试剂与多肽反应会导致甲硫氨酸侧链的丢失。大约22条注释提供了有关样本准备、数据采集和数据处理的有用提示。

Thumbnail from featured publication

Mascot 小贴士

在网页版本Protein Family Summary报告中的报告生成器(Report Builder)是一种功能强大的创建用户自定义蛋白列表的方法。您可以选择包含哪些列及其排序方式,过滤掉不感兴趣的蛋白质,例如one-hit wonder(只有一条肽匹配的蛋白),并可以导出csv格式的表格,直接用excel打开。

要查看Report Builder是如何工作的,请单击此链接加载典型的报告示例,展开Sensitivity and FDR部分,并将FDR设置为1%的peptide sequence(而不是PSM)。结果报告重新加载后,切换到Report Builder选项卡。

通过展开Filters部分,并且选择Num. of significant unique sequences > 1,点击filter,来过滤掉one-hit wonder的结果。你现在可以得到268个高可信度的蛋白列表。

若要对列进行选择和重新排序,请展开Column部分。使用"Arrangement"下拉列表加载已保存的排列,或在本练习中选择"custom"来配置新的列表设计。

"Enable"中,选择emPAI和Description,并将它们移动到"Available"。在"Available"下,为每个比率选择比值和多肽数目,并将所有14个项目移动到"Enable"。(若要同时选择多个项目,请按住ctrl并单击单个项目或通过按住shift并单击选择某个范围)。

很可能新选择的那些条目会出现在Enable列表的顶部。为了将它们移到列表的末端(将会出现在结果表格的右侧),选择所有要移动的项目,请使用列表下面的向下箭头。最后,选择Apply

你可以通过点击任意一列的顶部一栏,来进行排序。如果这是您本地的Mascot Server,并且您认为这个列表的安排将来可能有用,可以通过再次展开Column部分,输入合适的名称并选择保存来保存它。保存表头排列的前提是,你在登录Mascot security后进行个性化设置,如同这里所说的,也能对全局进行设置。

Report builder control

关于 Matrix Science

Matrix Science 为蛋白组学的研究人员以及科学家提供生物信息分析工具,帮助他们更快速,更可信的鉴定和定量蛋白。Mascot 软件全线支持来自Sciex, Agilent, Bruker, Shimadzu, Thermo Scientific 以及 Waters质谱仪生成的质谱数据。

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